Zapłodnienie in vitro u psów - krótka charakterystyka

Procedura kompleksowej produkcji zarodków ssaków w warunkach in vitro obejmuje kilka podstawowych etapów: dojrzewanie oocytów (ang. in vitro maturation - IVM), zapłodnienie (in vitro fertilization - WF) oraz hodowlę uzyskanych zarodków (in vitro culture -IVC). Technika ta znalazła zastosowanie u wielu gatunków zwierząt np. bydła, trzody chlewnej, owcy a także człowieka. Uzyskiwane wyniki wyrażające się m.in. udziałem zarodków osiągających stadium blastocysty zdecydowanie różnią się między gatunkami. Najlepsze efekty przynosi ta metoda w odniesieniu do człowieka i bydła, gdzie każdego roku na świat przychodzą tysiące noworodków wywodzących się z zarodków pozyskanych in vitro.

Jednakże wyniki doświadczeń z zakresu zapłodnienia in vitro oocytów psa domowego są dalekie od zadawalających. Jak dotąd opracowano warunki długotrwałego przechowywania mrożonego nasienia z zachowaniem jego zdolności zapładniającej, możliwe jest także przygotowanie plemników do zapłodnienia (kapacytacja) i dojrzewanie oocytów psa in vitro oraz uzyskanie zygot czy kilkublastomerowych zarodków Wciąż jednak nie udało się uzyskać szczeniąt wywodzących się z zarodków pozyskanych drogą zapłodnienia pozaustrojowego. Z czego mogą wynikać te niepowodzenia? W celu uzyskania odpowiedzi na to i inne pytania, w wielu laboratoriach naukowych na świecie prowadzone są w omawianym zakresie liczne eksperymenty. W zależności od rasy, pies osiąga dojrzałość płciową w wieku 4-12 miesięcy. Czas trwania rui u suki wynosi 7- 10 dni, a owulacja zachodzi między 1 a 4 dniem od początku rui. Ze względu na fakt, że suki należą do zwierząt monoestralnych, owulacja w warunkach naturalnych zachodzi dość rzadko co znacznie ogranicza dostęp do materiału badawczego czyli oocytów i zarodków.
U opisywanego gatunku wyróżnia się 4 fazy cyklu płciowego:
1. okres przedrujowy - ok. 10 dni:
2. okres rui - ok. 10 dni:
3. okres porujowy - ok. 100-130 dni:
4. okres spoczynku płciowego - ok. 30-80 dni.

Owulacja u suk przebiega nieco inaczej niż u samic innych gatunków zwierząt domowych. Około drugiego dnia po wyrzucie do krwi hormonu luteinizującego (LH) dochodzi do owulacji niedojrzałych oocytów (zatrzymanych w stadium profazy pierwszego podziału mejotycznego) posiadających ciemną cytoplazmę i otoczonych wieloma warstwami ściśle przylegających komórek pęcherzykowych. Oocyt uzyskuje dojrzałość do zapłodnienia (stadium metafazy drugiej mejozy) w środkowej części jajowodu po upływie 3-4 dni od wyrzutu LH. Warunkiem dojrzewania jest odpowiednie stężenie progesteronu, którego produkcja jest efektem procesu luteinizacji, rozpoczynającego się u psa już w przed owulacyjnym pęcherzyku. Dla porównania, u samic innych zwierząt gospodarskich (krowa, klacz, świnia) proces dojrzewania oocytów zachodzi w środowisku estrogenów, po czym wskutek wyrzutu LH dojrzała do zapłodnienia komórka jest owulowana. Luteinizacja pęcherzyka jajnikowego tych gatunków rozpoczyna się dopiero po owulacji.
W porównaniu do bydła, gdzie w warunkach in vitro około 80-90% oocytów uzyskuje stadium dojrzałości do zapłodnienia, u psa dojrzewa zaledwie 10-40% oocytów. Czas inkubacji niezbędny do uzyskania przez oocyty psa dojrzałości do zapłodnienia wynosi od 48-72 h. choć znane są również doniesienia mówiące o 24 h lub 72-96 h. Dla porównania, czas ten dla oocytów bydła wynosi około 24 h. Przypuszcza się także, że obecność plemników i innych składników ejakulatu może mieć znaczenie dla dojrzewania oocytów psa in vitro. Przeprowadzone badania dowodzą, że w obecności składników wchodzących w skład ejakulatu do zapłodnienia dojrzewa więcej oocytów. Poza tym wykazano dodatni wpływ albuminy bydlęce (BSA) oraz ludzkiego hormonu wzrostu (hST) na przebieg dojrzewania oocytów psa in vitro. Natomiast zarówno hormon folikulotropowy (FSH) jak i LH nie wpływają na udział dojrzałych komórek. Dużą rolę w procesie dojrzewania oocytu odgrywa niewątpliwie wiek suki. Doświadczenia wykazują, że więcej komórek pochodzących od młodych samic (poniżej pierwszego roku życia) nadaje się do dojrzewania in vitro w porównaniu z oocytami wyizolowanymi z jajników suk starszych, w wieku 2-3 lat. Ważnym elementem jest również stadium cyklu płciowego dawczyni. Badania wykazały, że oocyty pozyskane z jajników samic w okresie spoczynku nie wykazują zdolności uruchamiania zatrzymanego procesu dojrzewania mejotycznego. Nasienie psa może być przechowywane w formie świeżej w temperaturze pokojowej lub w formie mrożonej w ciekłym azocie. Wadą pierwszej metody jest to, że plemniki zachowują żywotność tylko przez 48-72 godzin.
Obecnie rutynowo stosuje się mrożenie nasienia psa i jego długotrwałe przechowywanie przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości i zdolności zapładniającej. Ułatwia to znacznie sprzedaż i transport nasienia, a także jego wykorzystanie w badaniach laboratoryjnych. Aby doszło do zapłodnienia, plemniki muszą ulec kapacytacji i zapoczątkować reakcję akrosomainą w celu penetracji osłonki przejrzystej oocytu. W przypadku psa opracowano metodyki pozwalające na przeprowadzenie procesu kapacytacji oraz reakcji akrosomalnej w warunkach in vitro. Okazuje się, że plemniki psa są zdolne do penetracji niedojrzałych oocytów. Penetracja stanowi jednocześnie bodziec do ponowienia procesu mejozy i osiągnięcia przez oocyty dojrzałości do zapłodnienia. Badania przeprowadzone na oocytach dojrzewających w obecności nasienia wykazały, że po 72 h inkubacji liczba oocytów dojrzałych była zdecydowanie wyższa w porównaniu z kontrolą. Gdy oocyty były inseminowane w obecności komórek jajowodu, penetracja zachodziła po upływie jednej godziny, a po 12 godzinach w 37.5% komórek widoczne były przedjądrza. Dotychczas uzyskano wczesne stadia rozwojowe zarodków psa w warunkach in vitro zarówno drogą zapłodnienia oocytów dojrzewających in vitro jak i in vivo, jednak nie zaobserwowano ich rozwoju powyżej stadium 8 blastomerów.
Wiadomo, że w tym stadium występuje u psa blok rozwojowy związany z uruchomieniem własnego genomu zarodka. Różnice w przebiegu owulacji między suką a samicami innych gatunków mogą wpływać na problemy z uzyskiwaniem zarodków w bardziej zaawansowanych stadiach rozwojowych w warunkach in vitro. Składa się na to również brak szczegółowych i precyzyjnych informacji dotyczących środowiska panującego w jajowodzie suki po owulacji oocytu i jego zapłodnieniu.
Opracowanie wydajnej procedury pozaustrojowej produkcji zarodków u psa cieszy się ogromnym zainteresowaniem naukowców, a przede wszystkim hodowców. Pies to przecież najlepszy przyjaciel człowieka, to także przewodnik ludzi niewidomych i ratownik (wodny, górski, trzęsienia ziemi). Może być wykorzystywany w leczeniu niektórych schorzeń ludzi (np. dogoterapia). Uzyskiwanie zarodków w warunkach in vitro przyczyni się - podobnie jak u bydła do znacznego postępu badań nad transgenezą czy klonowaniem u tego gatunku. Poza tym, w połączeniu z długotrwałym mrożeniem zarodków znacznie ułatwi obrót materiałem hodowlanym, tworzenie banków zarodków poszczególnych ras etc. Równie ważne jest i to, że pies coraz powszechniej jest uważany za bardzo ważny gatunek modelowy w badaniach niektórych schorzeń człowieka (np. cukrzyca, nowotwory, choroby układu krążenia). Ponadto, informacje zdobyte w doświadczeniach nad rozrodem psa domowego mogą być wykorzystane w programach zmierzających do ochrony dzikich lub ginących ras z rodziny Canidae. Z pewnością w krajach bogatych nie zabraknie też osób, które gotowe będą zapłacić każdą cenę za uzyskanie klonu swojego ulubieńca. Mimo że nie udało się jeszcze tego dokonać, niektóre firmy amerykańskie przechowują materiał nieżyjących osobników i obiecują ich klonowanie w najbliższej przyszłości.

Źródło: Serwis Molosy.pl www.molosy.pl